Sonderabdruck aus Hoppe-Seyler'e Ztschr. f. physiolog. Chem. `23fL Bd. (1935). fiber die Bedeutung der Fumarsikre fib- die tier&c-the ~ewebs~~~*). VOII E. Annau, I. Bangs, B. Wzsy, St. Euer~k, XL fiak%, B. Stmnb und A, Szent-GCyiirgyi. Mit 12 Figwen im Text. (Au3 dem Institut fiir medizinische Chemie, Univenitgt Szeged.) (Der Sobriftleitunp sugegangen am 20. Jnli 1935.) Einleitung, @bersicht, Xe&oden. VOII A. Szent-Gylfrgyi. Nach unserem heutigen Wissen ruht die Hauptatmung tier&her Gewebe auf zwei grol3en kat~ytischen Systemen, in denen die beiden Komponenten der Zelloxydation, Sauerstoff und N~hrstoff, aktiviert werden. Wie die Untersu~hungen War- burgs zeigen, wird einerseits der Sauerstoff aktiviert, indem er sich mit dem ,,Atmungsferment`~ verbindet, und das 2wertige Eisen seiner Hllmatinkomponente zu 3 wertigem Eisen oxydiert. Anderseits wird, wie uns Wieland lehrte, der Nlihrstoff aktiviert, dessen Wasserstoffatome duroh die Dehydrase aufgelockert werden, so da3 sie' in Gegenwart eines geeigneten ,,Wasserstoffaceeptors" abgegeben werden kdnnen. D. Keilin gebiihrt das Verdienst, gezeigt zu haben, da3 Atmungsferment und Dehydrasen nicht unmittelbar miteinander reagieren, sondern da6 zwischen beiden eine Serie von H&matinen, ,,Cytochrom" genannt, eingeschaltet ist, die einerseits duroh das Atmungsferment oxydiert, anderseits durch die N~hrstoffdehydrierung reduziert wird. In der Zelle stellt also dieses Atmungsferment-Cytochrom-System den physio- Xogisohen Wasserstoffacceptor der Hauptatmung dar. Wir wollen *) Die Ausfiibrung dieser Arbeit wurde durch die Unterstiitzung der Josiah-Macy- Jr.-Stiftung New York ermiiglicht. Hoppe-Seyler's Zeitschrift f. physiol Chemie. CCXXXVI. 1 2 A. Scent-Gybrgyi, es im folgenden ,,Warburg-Keilin-System" nennen und kurz- weg als ,,WKS" bezeichnen. Das eingehende Studium tierischer Dehydrierung verdanken wir Thunberg, der zur Untersuohung dieser Funktion seine bekannte Technik einftihrte, mit der er zeigte, da8 die tierisohen Gewebe zahlmiche organisohe Substanzen zu dehydrieren ver- miigen und somit Dehydrase fiir solche enthalten. Die quantitative vergleiohende Untersuchung der Dehydrasen war zur Zeit der ersten klassischen Untersuohungen Thunbergs wegen Unkenntnis der Co-Dehydrasen unmiiglich. In den letzten Jahren haben wir aber gelernt, daB die volle Aktivitiit zahlreicher Dehydrasen an die Anwesenheit von Co-Dehydrasen, Substanzen der Gruppe der Adenylnuoleotide, gebunden ist. Zwischen Dehydrierungen mit der Thunbergtechnik und dem AtmungsprozeB besteht in quantitativer Hinsicht eine gewisse Diskrepanz. Im AtmungsprozeS werden grol3e Mengen von Sauer- stoff aufgenommen rmd es werden ebenso grol3e Mengen von Wasserstoff durch die Dehydrasen mobilisiert. Hingegen werden duroh den Thunbergversuch schon die schwachsten Dehydrierungen mit grol3er Klarheit zum Nachweise gebraoht. Es ist also deutlich, da8 eine gtiJ3ere quantitative Bedeutung bei der Atmung nur denjenigen Dehydrierungen zukommen kann, die mit einer grol3en Intensit&t verlaufen. Untersucht man von diesem Standpunkte aus - unter Mitverwendung der Co-Dehydrasen - die zahlreichen bekannten tierischen Dehydrasen bzw. Wasserstoffdonatoren, so ergibt sich, da8 sioh unter ihnen nur eine geringe Anzahl be- findet, die eine geniigend intensive Aktivit&t zeigt, urn bei der Hauptatmung sine @;riiSere quantitative Rolle spielen zu k&men. Iri dem Material z. B., auf das sich unsere Untersuchungen beziehen (zerkleinerter Srustmuskel der Taube in Phosphat- &sung), fanden wir insgesamt nur 8 Dehydrasen, die dieser An- for&rung einer hohen Aktivitiit entsprachen, und zwar die De- hydrase fir: 1. Bernstein&me [Thunberg, Battelli und Stern*)& 2. MilchsBure, 3. Glyycerinaldehydphosphorsiiureester [Gozsy")], 4. Glycerinphosphors&ure [Ahlgren*)], 5. Hexose- monophosphat, 6. Hexosediphosphat [Broman, Thunberg*)], 7. Glutamins&ure [Thunberg, Holmberg*)], 8. Citronen- s&ure [Thunberg, Battelli und Stern*)]. o ) VgL Euler u. Hmrimn, a. a. 0. S. 16. l) Diese Z. 222, 279 ~1awS). ifber die Bedeutung der Fumar&ure fiir die tierische Gewebsatmung. 3 Mehrere dieser Dehydrasen sind aus verschiedenen tierischen Geweben schon seit Iangerer Zeit bekannt. Im wesentlichen haben alle diese Fermente ubereinstimmende Eigensohaften. Nur die Bernsteinsiiuredehydrase zeigt besondere Ziige, die, wie II. B. ihre hohe Resistenz und Aktivitiit, schon in den friiheren Tagen ihrer Erforschung auffielen. Vergleichen wir aber die genannten Dehydrasen unter Zuhilfenahme der uns heute zur Verfiigung stehenden Mittel, so wird die Ausnahmestellung der Succino- dehydrase durchaus iiberzeugend : 1. Untersucht man die Kinetik genannter Dehydrasen, so ergibt sich, da3 die Wirksamkeit der Fermente in ihrer Abhiingigkeit von der Substratkonzentration einen fiir Fermentwirkungen allgemein charakteristischen monomolekularen Typus zeigt. Wie aber Widmarkz) entdeckte, zeigt die Succinodehydrase einen durchaus verschiedenen Verlauf und gibt schon bei minimaler Substratkonzentration eine maximale Wirkung, gehiirt also den Reaktionen vom sog. Nulltypus zu. 2. Alle genannten Fermente bediirfen au ihrer vollen AktivitLt einer Co-Dehydrase. Allein die Succinodehydrase wird durch Co* Dehydrase nicht beeinflufit. 3. Im Respirometer verbraucht der gewaschene Muskel in Gegenwart von Bernsteinsaure entsprechend der starken De- hydrierung im Thunbergversuch grohe Mengen Sauerstoff. Der aktivierte Wasserstoff der Bernsteinsiiure wird also unmittelbar (lurch das anwesende WKS oxydiert. Hingegen vermogen die anderen Substanzen nicht - obwohl sie im Thunbergversuch ebenso energisch dehydriert werden - den Sauerstoff als Acceptor eu gebrauchen*). Da das Vermogen desselben Fermentprhparates, Bernsteinsaure aerob zu oxydieren, beweist, dal3 in ihm WKS in geniigender Aktivitat vorhanden ist, mu13 geschlossen werden, daf3 im Gegensatz zur Bernsteinsauredehydrase die anderen Dehydrasen mit dem WKS nicht in unmittelbarer Verbindung stehen. 4. Vom Blickpunkte des Zwischenstoffwechsels ist bemerkens- wert, da13 abgesehen von der Bernsteinsiiure, Glutaminsaure und CitronensBure die genannten Verbindungen der C,-C,-Gruppe angehiiren, die dort eine so bedeutende Rolle spielen. Hingegen 2) Skasd. Arch. Physiol. 41, 200 (1921). *) Nur das Hexosediphosphst vermag eine relative geringe Menge van Sauerstoff aufzunehmen. 1* 4 A. Szent-Gybrgyi, ist van' der 4 C-atomigen Bernsteinsiiure keine solche ,Rolle nachgewiesen. 5. Im gleichen Sinne sprioht such das Bestehen der von Einbecka) ehtdeckten Fumarase, die Fumarsiiure, das Oxydations- produkt der Bernsteinsiiure, unter Wasseraufnahme zu ;ipfel- sliure verilndert. Aus reiner Fumarsiiure entsteht unter Ein- wirkung von Fumarase ein im Gleichgewicht stehendes Gemisch van Fumar- und Apfelsgure im Verhlltnis 1 : 3. Reine Apfelsiiure wird durch Fumarase unter Wasseraustritt ebenfalls in das Gleich- gewichtsgemisch iiberfiihrt. Zusammen mit der Bernsteinsiiuredehydrase ist Fumarase &es der aktivsten bekannten Fermente. Was sol1 es nun be- deuten, daB die Zelle fiir Bernsteinsiiure, Fumarsgure, dpfelsiiure die aktivsten Fermente beherbergt, die regelmiil3ig offenbar nicht. als Zwischenstufen im Abbau der Niihrstoffe entstehen? 6. Auf die ganz besondere Funktion der C?,-Dicarbonsguren wies zuletzt such die immer noch unerkliirte, merkwiirdige Be- obachtung Thunberg#) hin, daB MaleinsSiure die Atmung weit- gehend vergiftet, obwohl sie selber als Donator auftritt. Malein- sSiure hat keinen Einflufi auf die bekannten Glieder des Atmungs- systems, und ihre einzige besondere Eigentiimlichkeit ist die, daI3 sie such dieser merkwiirdigen Gruppe der C,-Dicarbonsguren angehijrt . Diese Beobachtungen lieSen vermuten, daB den C,-Dioarbon- sluren und den zugehijrigen Fermenten ihren besonderen Eigen- schaften entsprechend auoh eine besondere Funktion zukommt, und daf3 diese an der Atmung nicht als Nlihrstoffe, sondern als Katalysatoren beteiligt seien. Urn weitere Anhaltspunkte zu bekommen, wurden durch zwei von uns [Giizsy und Szent- Gy6rgyi5)] Versuche ausgefiihrt, die neue Beweise fiir die Aus- nahmestellung der genannten Substanzen erbrachten. Es wurde versucht, die Bernsteinsiiuredehydrase in spezifischer Weise aus- zuschalten, urn zu beobachten, welchen EinfluB dies auf die Atmung babe. Dies konnte auf Grund der Arbeit von Quastele), sowie Quastel und Wooldridge') durch Malonat geschehen. Es zeigte sich, dal3 die Atmung duroh Malonat weitgehend gehemmt wird, 8) Biochem. 2. 96, 297 (1919). *) Skand. Arch. Physiol. 40, 1 (1920). 5, Diese Z. 224, 1 (1934). f) Biochefnic. J.-WI, 166 (1926). `) Biochemic. J. 22, 689 (1928). ifber die Bedeutung der Fumars&ure fiir die tier&&e Gewebsatmung. 5 obwohl dieses Gift weder N~hrstoffdeh~drier~~, noch Sauerstoff- a#ktivierung beeinflu5t. Die Intensitlit der Giftwirkung ist von derselben Gr~5enordnung wie die des Cyans. Kommt also den C,-Dicarbonsauren bei der Atmung eine katalytische Rolle zu, und wurde duroh ihre -4usschalt~g die Atmung stillgelegt, so mu5te such versucht werden, ob durch ihre Zugabe die Atmung nicht erhoht wird ? Eine Atmu~~ssteiger~g durch Fumarat wurde bereits durch Thunbergs) beobachtet und von Gr6nwalls) studier%. Gozsy und Szent-Gyorgyi zeigten, da5 die Fumar- saure unter Umstanden die Atmung urn mehrere lOOo/o zu steigern vermag. Das besonders eigent~~iche dieser Steigerung war aber, da5 das Fumarat hierbei nicht verbraucht wurde, also im Gegen- sat.z zu anderen ~hnliehen beschriebenen atmungssteigernden Sub- stanzen nicht als Donator, sondern als Katalysator wirkte. Da5 es sich hier nicht urn die Aktivierung eines k~nst~ch hergestellten Systemes handelt, zeigen die hier zu berichtenden Analysen. Nach Banga wird durch Fumarat die Atmu~g eigent- lich nicht ,,gesteigert", sondern nur ,,konserviert". Das in Phos- phat suspendierte Gewebe verliert ge~~~hnlich rasch von der Intensitat seiner Atmung. Dieses Sinken der Atmung wird durch ~unlaratzusatz hi~ltangehalten. Das Gewebe enthalt normafer- weise geringe Mengen Fumarat, die bei der Suspendierung des Gewebes durch Diffusion verloren gehen; deshalb sinkt die Atem; hohe. Wird das Wegdiffundieren durch Kompensationsdialyse (d. h. durch Zufiigung von Fumarat zur Au5enfl~ssigkeit) ver- hindert, so bleibt die Atmung erhalten. `Van gro5er Bedeutung hierbei ist der Umstand, da5 zur Erreichung solcher Wirkungen schon sehr kleine Fumarat- konzentrationen geniigen, die der normalen Fumaratkonzentration des Muskels gleich sind. Dieser Umstand entkraftet den Einwand, da5 das Fumarat des Muskels wegen seiner geringen Konzentration fur die Atmung keine Bedeutung haben k&me. Es lag auf der Hand daran au denken, da13 das Suocinat den Wasserstofftransport zwischen N~hrstoffdehy~rase nnd WKS ver- mittle, indem es durch letzteres zu Fumarat oxydiert, durch erstere zu Succinat reduziert wird. Es ist bekannt, da5 an der Suocino- dehydrase nicht nur das Succinat unter Dehydrierung als Donator, sondern ebenso energisch such das Fumarat unter Hydrierung 8, Skrtnd. Arch. Physiol. 24, 23-M (1911). $) Skand. Arch. Phpiol. 45, 303 (1924). 6 A. Szent-Gybrgyi, als Wasserstoffacceptor aktiviert wird. Diese einfache Theorie hlitte all den aufgeziihlten Beobachtungen eine befriedigende Er- kllirung gegeben. Die Theo& stand aber im Widerspruch mit folgenden Beobaohtungen: 1. Wie Gijzsy nnd Szent-Gybrgyi fanden, ist die durch Fumaratzusatz stabilisierte Atmung niaht durch Malonat hemm- bar, Liefe der Wasserstofftransport iiber die Succinodehydrase, so miiSte die Atmung in jedem Fall durch Malonat gehemmt werden. 2. Das dem Muskel unter anaeroben Bedingungen zugesetzte Fumarat wird nioht oder nur liuJ3erst langsam reduziert. 3. Malonat entfaltet seine Atmungshemmung, Fumarat seine Atmungssteigerung nur in Phosphat und nicht in Ringerlbsung. Es konnte nioht angenommen werden, da13 ein fundamentaler ProzeB sich je nach der Suspensionsfliissigkeit versohieden ver- halte. 4. Das dem gewaschenen Muskel zugesetzte Succinat war nicht imstande, die fehlende Verbindung zwischen N&rstoff- dehydrasen und WKS herzustellen. 5. Die Theorie gab keine E&l&rung fti die Funktion der Fumarase. Wahrend also einerseits Beobachtungen in zwingender Weise zeigten, da8 das Fumarat als Katalysator im Mittelpunkte der Atmung stehe, zeigten Versuohe ebenso deutlioh, da13 die Atmung nioht iiber die Sucoinodehydrase, d. h. iiber den Wechsel Succinat- Fumarat laufen kiinne. Es wurde also untersucht, ob das Fumarat die Funktion des Wasserstofftransporteurs nicht durch seinen Weohsel mit einer hdheren Oxydationsstufe austiben kiinne. Urn nun festzustellen , welche von den mijgliohen nlohst hsheren Oxydationsstufen in Frage kommen kann, wurde in doppelter Weise vorgegangen. Einerseits untersuchte Banga, welche von den in Betraoht kommenden Substanzen das Fumarat in seiner stabilisierenden Wirkung ersetzen kbnne. Es zeigt sich hierbei, da8 in dieser Hinsicht wohl nur die Oxalessigsiiure aktiv ist und in jeder Beziehung der Fumarsiiure gleich wirkt. Ander- seits untersuchte Laki, welche von den in Betracht kommenden Subdtanzen im Gewebe als Acceptor aktiviert wird. Dies war tiberhaupt nur mit der OxalessigsBure der Fall. 1st also das Fumarat mit einer haheren Oxydationsstufe an der Atmung be- teiligt, so kann diese hiihere Oxydationsstufe nur die OxalessigsBure sein. Fiir eine miigliche Bildung von Oxalessigsiiure aus Fumarat fiber die Bedeutung der ITumarzWre fiir dii tierische Gewebsatmung. 7 haben bereits Hahn, Haarmann und FischbaohlO) Beweise erbraoht. Nacbdem also unsere Aufmerk~mk8it auf die Oxalessigsiiure gelenkt war, mu&e zuniichst die mijgliche Oxydation des Fumarats und Reduktion des Oxala~etats untersucM werden. In diesen, durch Banga ausgefuhrten, von Gozsy orgiinzten Versuohen zeigte sich, daB das untersuohte Gewebe (Taubenbrustmuskel in Phosphat) die zugesetzte Oxalessigsiiure r-nit groBer Gesohwindig- keit zum Versohwinden bringt. Nach St r a u b kommt der Schwund durch Reduktion zu Fumarat zustande. Die durch das Gewebe in der Zeiteinheit reduzierbare Menge des Oxalaoetats iibertraf in Aquivalenten den gesamten, bei der Atmung aufgenommenen Sauerstoff, so da13 festgestellt werden konnte, daS Oxalaoetat durch das Gew-ebe mit einer gentigenden Geschwindigkeit redu- ziert werden kann, urn die gesamte Atmung bzw. den Transport des gesamten Wasserstoffes zu tragen. Bestand nun die Atmung gem&B unserer Anschauung aus einer wechselnden Oxydation und Reduktion des Fumarats, so war es aus den genannten Angaben deutliah, daB die Reduktion des Oxalacetats raseher als ihre Bildung aus Fumarat verlaufen m&se und daB man somit beim in Phosphat suspendierten Muskel such bei Fumaratzugabe kein Oxalacetat naohweisen kiinne. Die Bildung des Oxalacetats konnte nur nachgewiesen werden, wenn es gelang, seine Reduktion starker als seine Bildung zu hemmen. Dies gelang mit Arsenit. Wird das Gewebe mit Arsenit aerob bebriitet, so wird die ~~asserstoffaktivie~ung der N~hrstoffe -Fireit- gehend unterdrucktlf). Es scheint, dab duroh diese Arsenit- behandlung die Dehydrasen vergiftet werden. Nicht alle De- hydrasen leiden aber in gleicher Weise. Wiihrend z. B. die Milch- s~ure~lehydrase ganz vernichtet wird, wird die Su~cinodehydrase, die Glutaminsliure- und Hexosediphosphatdehydrase nicht oder nur wenig gebemmt. Auch die Fumardehydrase gehiirt zur Fer- mentgruppe, die durch die Arsenitbehandlung weniger leidet. Duroh das Arsenit wird die Wasserstoffmobilisier~g der Nahr- stoffe in hoherem MaIje wie die Fumaroxydation unterdriickt, so da8 sich also hier die M~glichkeit einer Anreicherung von Oxal- 10.) Hahn, Haarmann, Z. Biol. 87, 465 (1928); Hahn, Hactrmann II. Fischbach, Ebenda 88, 587 (1929). 11) Szent-GyBrgyi, Biochemic. J. 24, 1723 (1930); I. Banga, L. Schneider u. A. Szest- GyBrgyi, Bioehem. Z. P&l, 462 (1931); I. Blanga, A. Szent-Gytirgyi, Biochem. Z. 246, 203 (1932). 8 A. Szent-Gybgyi, acetat und damit seines Na~hweises ergibt. Es konnte aber nicht erwartet werden, die gesamte gebildete Oxalessigsiiure wieder- zufinden, da einerseits die Fumardehydrase durch Arsenbehandlung selber such leidet, andererseitsdie Wasserstoffmobilisierung,wie auoh die gesamte Atmung durch Arsenit nicht g&s&h, sondern bloB zu 70-75O/,, unterdrtickt wird. Arsenit verursacht also keine quali- tative Anderung, sondern bloB eine Verschiebung der normalen Verh~ltnisse. Diese Vers~hiebu~g `ist aber grol3 genug, urn das Oxalacetat zum Nachweis zu bringen. Wurde das Gewebe mit Arsen vorbehandelt , dann mit Fumarat bebriitet, so trat Oxal- acetat in nicht unbetriichtlicher Menge auf. Lauft der gesamte Wasserstofftransport iiber Fumarat-Oxyfumarat, so mu13 1 g Ge- webe in 10 Minuten insgesamt annahernd 8 mg Oxyfumarat (die dem verbrauchten 0, iiquivalente Mange) bilden. Hiervon konnte mit Hilfe des Arsenits 1 mg tats~ch~ch nachgewiesen werden. dhnlich, wie Arsenit, wenn such schwacher und weniger zu- verllif%ich, wirkte such Maleinat (0,05 Mol.).. Stand nun die Bildung des Oxalacetats feet, so gait es, ein entsprechend aktives Ferment der Oxydation des Fumarats naoh- zuweisen 2mal gewasehener Musket vermag Farbstoffe in Gegen- wart von Fumarat auoh mit Co-Dehydrasezusatz nur sehr sohwach zu dehyd~eren. Also entweder ist keine Fumardehydrase im Gewebe vorhanden, oder aber sie mu&e beim Auswaschen ver- schwinden. Ungewaschenes Gewebe kann aber wegen der starken spontanen Reduktion nicht zum Thunbergversuch verwendet werden. Wurde durch Arsen vorbehandeltes Gewebe heran- geaogen, das Farbstoffen gegen~ber ein stark ver~ndertes Ent- fiirbungsvermogen hatte, so wurde durch Fumaratzusatz die Ent- f~rbungsz~it stark vermindert, als Zeichen dessen, da8 das Gewebe eine intensive Fumardehydrase enthielt. Die weitere Analyse zeigte, da8 duroh das Waschen des Muskels die Fumardehydrase nicht inaktiviert, sondern bloB herausgel~st wurde und aus der Waschfltissigkeit mit hoher Aktivitat und relativer Reinheit zur~ckgewonnen werden konnte. Das auf diese Weise hergestellte Fermentpraparat zeigte, dai3 die Fumardehydrase eine sehr hohe Aktivitii;t besitzt, die, beurteilt nach der Entfiirbungszeit, geniigend groS ist, urn die gesamte Atmung bzw. den gesamten Wasserstoff- transport tragen zu kiinnen. L aki s Messungen zeigten such, daS dieses Ferment - ahnlich der Bernste~s~~edehydrase - so gebaut ist, dai3 es fahig ist, schon mit minimalen Substratmengen maximal zu arbeiten, so daB also such in dieser Beziehung nichts ober die Bedeutung der Fumarsilure fiir die tierische Gewebsatmung. $j der Annahme im Wege steht, daS dieses Ferment, zusammen mit der natiirlicherweise im Muskel anwesenden Fumarsiiure, die ge- samte Atmung vermittele. ?V~hrend aber die Bernste~s~uredehy(~rase in gleicher W&e 0, und Farbstoffe als Wasserstoffacceptoren zu benutzen vermag, ist die Fumardehydrase unfghig, 0, als Acceptor zu gebraucben, d. h. aerob Fumarat zu Oxalacetat zu oxydieren, obwohl die Fumar- dehydrasepr¶te stets eine aktive Succinodehydrase und damit such ein aktives WKS enth~lten. Die weitere Arbeit Bangas ergab, da6 im Muskelgewebe ein thermolabiler Faktor anwesend ist, der die Fumardehydrase be- fghigt, 0, als Wasserstoffa~eepto~ zu gebrauchen, d. h. Fumarat aerob zu Oxalacetat zu oxydieren. Die chemisohe Natur dieser Substanz, die die Fumardehydrase mit dem WKS verbindet, wurde noch nicht n&her untersucht, Die Substanz sol1 fortan ,,Zwischensubstanz" genannt werden. Wie eingangs erwHhnt, ist das System: ~~hrstoffdehydrase, NBhrstoff, plus WKS unfHhig, Sauerstoff aufzunehmen, da die Yerbindung zwischen den beiden Fermenten fehlt. Wird hin- gegen dieser Komplex mit folgenden Gliedern ergtinzt: Fumar- dehydrase, thermolabiler Faktor plus Fumarat, so erh< man ein System, das alle typischen Eigenschaften der Normalatmung (~~alonhemmbarkeit, Steigerung duroh Fumarat) zeigt, als Zeichen dafiir, da13 mit Einfiigen dieser Glieder der htmungszyklus voll- stgndig geworden ist. Es &Bt sich also sagen, dal3 in der Kette der biologischen Oxydation zwischen WKS und NSihrstoffdehydrierung ein System des ~Vasserstofftransports eingeschaltet ist. Dieser Wasserstoff- t~ransport wird durch die Fumars&ure vermittelt, die - aktiviert duroh die Fumardehydrase - abwechselnd zu Oxalaeetat oxy- diert, und wieder zu Fumarat reduziert wird. Die Oxydation des Fumarats wird, dem WKS zu, duroh die noch nicht n%her definierte Zwischensubstanz vermittelt. Auf Grund dieser Ergebnisse kann also das Atmungssystem fo~genderma~en dargestellt werden: OS--WKS-Zwischen- Fumarat 7: Oralacetat Niihrstoffe substanz ~uma~ehy~ase Nithrstoffdehydrasen Co-Dehydrase Co-Dehydrasen Dieses Atmungsschema gibt aber keine ErklBrung f3r die ~4tmungshemmung durch ~falonat, die in unserer ganzen Arbeit zusammen mit der Fumarkatalyse die fundamentale Beobachtung 10 A. Seed-Gyorgyi, bildete. Die Fumardehydrase ist ebenso wie die anderen Glieder dieser Kette, malonunempfindlioh. Das Problem des Mechanismus der Malonathemmung wurde in eindeutiger Weise durch Straub gel&t. Die von Straub aus- gebaute Mikrofumarsiiurebestimmung gestattete es, das Sohicksal der Fumarsiiure unter Wirkung des Malonats quantitativ au ver- folgen. Diese Fumardurebestimmungen zeigten, dal3 unter Ein- wirkung des Malonats die FumarsZiure verschwindet und hierdurch die Fumardehydrase ihr Substrat und die Zelle ihren katalytisohen Wasserstofftransporteur verliert, wodurch die Atmung zum Still- stand kommt. " Die Versuche Straubs wurden durch Gozsy erglinzt, der mit seiner Mikrobernsteinsiiurebestimmungsmethode zeigte, dal3 das verschwundene Fumarat zu Bernsteinsliure reduziert wird und als solches nachgewiesen werden kann. Hierdurch kliirte sich such der Mechanismus des Fumaratschwundes: im AtmungsprozeB wird stets ein geringer Teil des anwesenden Fumarats zu Bernsteinsaure reduziert. Unter normalen Umstilnden wird diese Bernsteinsilure duroh die Suocinoxydase sogleioh wieder zu Fumarat reoxydiert und somit ihrer Funktion zuriickgegeben. Die besondere Kinetik der Bernsteinsiiuredehydrase befiihigt dieses Ferment, sohon die geringsten Spuren des entstandenen Succinats mit maximaler Gesohwindigkeit, unverziiglich zu reoxydieren. Duroh Malonat wird die Sucoinodehydrase vergiftet und somit wird such diese Reoxydation des Succinats verhindert. Hiermit erkliirte sich also nicht nur der Mechanismus der Malonathemmung, sondern zugleich such die Funktion und besondere Kinetik der Suocinodehydrase. Obwohl die, duroh die Sucoinodehydrase in der besohriebenen Weise, duroh Reoxydation des Suocinats vermittelte Sauerstoff- aufnahme nur einen geringen Teil (5o/o) der gesamten Sauerstoff- aufnahme des Gewebes bildet, bleibt bei Vergiftung der Bernstein- siiureoxydase die Atmung stehen, da die geringe Menge der als Katalysator wirkenden Fumarsaure, bald au BernsteinsZiure redu- ziert, nicht mehr reoxydiert, und somit ihrer Funktion entzogen wird. Durch Inaktivieren der Sucoinodehydrase wird durch das Malonat dem Fumarat gleiohsam eine Falle gelegt, in dem es als Succinat gefangen und als solches stabilisiert wird. 1 g Gewebe reduziert in dieser Weise in 10 Minuten kaum mehr als 0,5 mg Fumarat zu Succinat. Die Menge der nattirlich an- mesenden Fumarsliure ist aber so klein, da13 bereits diese schwaohe Reduktion geniigt, urn unter Wirkung des Malonats die gesamte tiber die Bedeutung der Fumarskre fiir die tierisohe Gewebsatmung. 11 Menge des natiirlichen Katalysators binnen 2 Minuten ala Bern- steinsiiure zum Schwinden zu bringen. Durch diese Messungen erlangt such die zweite, sonst so widerspruchsvoll ersoheinende Beobachtung, dal3 Malonat wohl die naturliche, nicht aber die durch Fumaratzusatz stabilisierte Atmung hemmt, eine einfache Erkllirung. Wahrend der Muskel in Gegenwart von Malonat die natiirlicherweise anwesenden 0,04 mg Fumarat in 2 Minuten zu Suooinat umsetzt, benotigt er zur Umsetzung der gewiihnlioh zugesetzten 2,4 mg Fumarat zwei volle Stunden, wiihrend welcher Zeit die Atmung trotz der An- wesenheit des Malonats ungehindert weiter gehen kann. Da unsere Versuohe nie liinger als 1 Stunde fortgesetzt wurden, kam die Hemmung nicht mehr zur Beobachtung. Mit geringeren Mengen des Fumarats erhalt man in Gegenwart von Malonat zuerst die erwartete Atmungssteigerung, dann aber, nach der fiir die Re- duktion de8 Fumarate notigen Zeit, die erwartete Atmungs- hemmung. Unerwarteterweise soheint da8 Succinat nioht au8 Fumarat, sondern durch eine ,,nberreduktion" aua Oxalacetat gebildet zu werden, da diese Reduktion zu Succinat nur bei aerober Bebriitung stattfindet, wenn der Fumarsiiure Gelegenheit gegeben ist, sich zu Oxalacetat zu oxydieren. Anaerob wird in Gegenwart von Malonat kein Succinat gebildet. Der mittlere Teil de8 obigen Atmungsschemas mu2 also folgendermaBen erg&net werden: sncOinakt / Fumardehydnase Die gebrochene Linie gibt die Stelle an, an der Malonat wirkt und den Atmungszyklus unterbrioht. Aus diesem Atmungsschema wird ea deutlich, da2 Malonat nioht, wie z. B. Cyan, in einer absoluten Weise wirken kann. Da8 AusmaB der Malonathemmung wird von dem relativen Verhaltnis einer Reihe von Prozessen abhiingen. An erster Stelle wird die Succinodehydrase durch Malonat nioht vollstandig vergiftet . Eine geringe Oxydation de8 Succinats geht such in Gegenwart voa 12 A. Szent-Gycrgyi, Malonat stets vor sich. Die Geschwindigkeit dieser Oxydation ist von den relativen Mengen de8 bereits gebildeten Succinats und de8 zugesetzten Malonats abhiingig. Da8 gebildete Succinat wird also, wenn such langsam, doch such in Gegenwart von Malonat mit gut definierbarer Gesohwindigkeit oxydiert, so da8 Malonat nie eine 100o/,ige Atmungahemmung geben kann. Das AusmaB der Malonathemmung wird also von der relativen Intensitat der Reduktion de8 Oxalacetats zu Sue&at und der Reoxydation des Succinats abhangen. Die Inter&at dieser Reduktion des Oxalacetats zu Sue&at muB wieder eine Funktion der relativen Leistungsfiihigkeit der Fumaratoxydation und der Wasserstoff- mobilisierung der Nahrstoffe sein. 1st unter diesen beiden Pro- zeaaen die Oxydation de8 Fumarats relativ stark, 80 wird der aktivierte Wasserstoff durch dieses aufgebraucht und es bleibt kein WasserstoffiibersohuB, der zu einer ifberreduktion des Oxal- acetats fuhren konnte. In diesem Falle mul3 da8 zugesetzte Malonat relativ wirkungslos bleiben. Ebenso bleibt such da8 Fumarat wirkuIq&8, da doch bereits ohne Fumaratzugabe Oxalacetat im ~berschufi vorhanden ist. 1st hingegen die Wa88eIYtOffmObili- sierung relativ atark, wie dies in Phosphat (dank der starken Rhoa- phorylierung) der Fall ist, SO wird es eher zu einer Uberreduktion de8 gebildeten Oxalacetats und somit zu einer starken Malonat- hemmung kommen. Diese intensivere Wasserstoffmobilisierung wird such in einer intensiveren Atmung ihren Ausdruck finden. Von diesen Bedenken geleitet, hat Straub bei einer gro%eren Anzahl von Versuchen die gemessene Atmungsintensitlit mit der Malonathemnmng und der Succinatbildung in ein Koordinaten- system gebracht, und gefunden, daB beide Grogen, sowohl die Malonathemmung, wie die, mit ihr im Wesen identisohe Succinat- bildung Funktionen der Atmungsintensitiit sind. Die Bildung de8 Oxalacetats ist von Phosphaten unabhiingig lauft also, wie Banga zeigte, mit gleicher Intensitat in Phosphat- oder Ringerlosung. Nicht 80 die Wasserstoffmobilisierung der Niihrstoffe. Schon mit Zuhilfenahme von Farbstoffen oder Oxal- acetat l&fit sioh zeigen, da6 in Ringerliisung die Wasserstoffmobih- sierung gegeniiber Phosphat deutlich vermindert ist. In Ringer- losung verschiebt sich also da8 -Verhaltnis der Fumaratoxydation und der Wasserstoffmobilisierung zugunsten des~ersteren. Diese Verschiebung konnte durch Banga in eindeutiger Weise de- monstriert werden. In einer gr6Beren Anzahl von Versuohen zeigte Banga, da& wahrend der in Phosphat suspendierte Muskel aus Umber die Bedeutung der l?umar@ure fiir die tierisehe Cewebsatmung. 13 Fumarat kein Oxalacetat bildet bzw, dieses ebenso rasch wieder reduziert, wie es gebildet wird, im Muskel, der in Ringerlosung snspendiert und mit Fumarat bebrutet wird, stets Oxyfumarat in deutlich na~hweisbaren Mengen vorgef~den wird. Dement- sprechend fand such St raub, da8 der in Ringerlosung suspendierte Muskel such in Gegenwart von Malonat kein Fumarat zu Suocinat reduziert, oder aber dieae Reduktion ist, verglichen mit Phoaphat, nur HuBerst goring und kommt nur bei aehr geringen zugesetzten Fumaratmengen cur Beobachtung ( bei denen nur wenig Sucoinat angeh~uft werden ka;nn, somit die Gesch~ndigkeit der Reoxy- dation des Sucoinats gering bleibt). Dies erkllirt dann auoh die sonat a0 widerspruchsvoll erscheinende Beobachtung, da8 zu- gesetztes Malonat und Fumarat in Ringerl~s~g vie1 weniger wirken oder ganz unwirksam bleiben. Da8 auf S. 16 wiedergegebene Atmungsschema gibt also eine befriedigende Erkliirung fiir alle in dieser Arbeit bes~h~ebenen Beobachtungen. Nur einer der einganga aufgeziihlten Punkte blieb unbeantwortet, die Frage nach der Bedeutung der Fumarase. Diese Frage hlingt mit dem zur Zeit noch ungeliisten Problem der prim&en Reaktionsprodukte zuaammen. Die Moglichkeit steht giinzlich offen, dai3 bei der Oxydation des Sue&tats nicht, wie allgemein angenommen, Fumarat, sondern Malat entsteht und die Fumarase die Aufgabe hiitte, dieses Malat in Fumarat um- zuaetzen. Ebensowenig wisaen wir tit Sicherheit, was das prim&e Reduktionsprodukt der Oxalessigsiiure ist. Dieses kann kaum eine andere Substanz sein ala Apfelsiiure und die wahrscheinliohe Funktion der Fumarase ist die, diese Apfelsiiure zu Fumarat um- zuaetzen, da Malat, wie durch Laki gezeigt, selber nioht de- hydriert wird. Unbeka~t ist such das prim&e Oxydationsprodukt des Fumarats. Aller Wahrsoheinlichkeit nach ist dies das Oxyfumarat, das sich in neutraler LBsung rasch zum grogten Teil in die Keto- form umsetzt. Ob Ox~umarat in den Geweben schon ala aolohes oder erst ala Oxalacetat reduziert wird, wird wohl von den noch unbekannten relativen Gesohwindigkeiten der einzehren Prozesse abhtingen *). Da Oxyfumarat , Oxymaleinat und Oxalacetat in neutraler Lijsung miteinander im Gleichgewichte stehen, ist es *) Wird der gesamte W&~e~~fftr&n~po~ van Fumtarst getragen, so muB jedes Molekiil dea ,,Fumarats" im Mu&e1 anniibernd Smal in der Minute oxydiert und reduziert werden. 14 A. Scent-Gyargyi, unmdglich, experimentell unter diesen drei Substanzen zu unter- seheiden. Darum wird in vorliegender Arbeit durchweg nur iiber ,,Oxalacetat`" gesproohen, mit dem Vorbeh~lte, da&! es ganz offen bleibt, mit welsher Form die Substanz tat~chliah in Reaktion tritt . Es sei nun zum SchluS naohdriicklich betont, dab alle unsere Untersuchungen sich in erster Lime auf zerkleinerten, in Phosphat suspendierten Brustmuskel der Taube beziehen. Solch ein Muskel ist kein ruhender, normaler Muskel und die Verh~ltnisse in diesem System sind den normalen gegenuber stark verzerrt. Es kam uns aber nicht darauf an, die Verh<nisse des normalen, ruhenden Muskels festzustellen, sondern den Mechanismus zu erforschen, der die Grundlage der Atmung bildet. Erst durch diese Verzerrung der normalen Verhaltnisse ist die vorliegende Analyse ermiiglicht worden. Es ist eine Grundbedi~g fiir die Analyse eines so komplexen, inner&h &u~eg~~henen Systems, wie die Atmung, den Mechanismus zu verzerren oder zu zerlegen und hierdurch seine einzelnen Teile in Erscheinung treten zu lassen. Es fragte sieh zuletzt, ob sioh die mit zerkleinertem Muskel erhobenen Befunde auoh auf andere Gewebe iibertragen lassen, eine Verallgeme~er~g erlauben, oder aber nur einen S~zi~lf&ll bilden, Es war wunschenswert, die Versuche mit einer Methode zu wiederholen, die den physiologischen Bedingungen n&her steht. Dieser Aufgabe hat sich Annau unterzogen. Er findet, da8 die erhobenen Befunde sioh auf andere Gewebe, wie Leber und Niere, iibertragen lassen. Aus diesen Geweben k&men, im Gegensatz zum Muskel, auoh Sc~tte angefertigt werden, die duroh manche Forscher als mit normalem Gewebe gleichwertig betrachtet werden. Daher wurde die Untersuohung auf Schnitte ausgedehnt, und Annau findet, daIS im Verhalten der Sohnitte und des an der Latapimaschine hergestellten Gewebsbreies keine wesentliohen Unterschiede bestehen. Gleioh~it~ zeigte Annau, da8 das auf den ~marat~~us slosh ein~rkende Malonat tief~eifende Verschiebungen im chemischen Mechanismus des intermediiiren Stoffwechsels verursaoht, ein weiterer wichtiger Beweis, daB der durch Malonat beeinfluBte Mechanismus im oxydativen Zellstoff- wechsel eine zentrale Rolle spielt. Immerhin aber hat man keine Sicherheit, dal3 selbst die Gewebeschnitte die normalen Verh~lt~~e widerspiegeln. Darum hat es Ku s z S k unternommen EU untersuchen, ob die Ver- schiebungen im Chemismus des Stoffwechsels, die in vitro be- tiber die Bedeutung der Fumar~We fiir die tierische Gewebsetmung. 15 obachtet wurden, such im ganzen Tier reproduzierbar sind. Wie im letzten Teile dieser Arbeit berichtet werden soll, ist dies tatsiichlich der Fall. Zum Schlusse &en noch zwei Umstande namhaft gemacht, die die besc~iebene Rolle des Fumarats bedenklich erscheinen lassen bonnten. Seit Neuberg und Tirsr2) Untersuohungen ist es bekannt, datB Oxalessigsiiure durch Gewebe zu Brenztrauben- siiure decarboxyliert wird. Nach Wieland13) sol1 sogar gekochter Muskel iihnlieh wirken. Hahn, Haarmann und Fisohbaohr4) h8ben sioh mit diesem ProzeB eingehend besahaftigt. Wird das Oxalacetat decarboxyliert, so ist es fur die katalytische Funktion des W8sserstofftranspo~es verlorengegangen. Dies% Decarboxp lierung ist aber ein relativ langsamer ProzeEI, wiihrend dessen die Lebensdauer der einzehren O~lessigs~uremolek~e dank der raschen Reduktion nur sehr kurz sein kann. Sollte sioh Oxalacetat aus irgendeinem Grunde anhaufen, so kann die Decarboxylation sicherlich zum Schwunde der Substanz fiihren. Husziiks und S traubs Arbeiten geben direkte Beweise dafiir, daB dies such t,ats~ohlioh der Fall sei, und da8 das Fumarat, d8s nicht zur Kata- lyse niitig ist und somit nioht mit geniigender Geschwindigkeit reduziert wird, t8ts~ohlioh such auf diesem Wege verschw~det. Sollten im Stoffweohsel stets geringe Mengen Sucoinats bzw. Fumsrats gebildet werden, so wird ihr zur Katalyse unndtiger fjberschul3 durch diese von Hahn und Mitarbeitern beschriebene Reaktion entladen, die gleichsam wie der AbfluS am Wasser- bade wirkt. Es mag vielleicht befremdend wirken, einer so einfachen Substanz wieFum8rat eine so gr~dlegendeFunktion z~uso~eiben. Es sei aber detrauf hingewiesen, da13 Suocinat bzw. Fumarat - strukturchemisch betrachtet - ganz einzig dastehende Sub- stanzen sind. Bekanntlich haben die IX- und #?-C-Atome stets besondere Eigenschaften, die sioh in ihrer besonderen Reaktions- f~higkeit k~dgeben. Nun gibt es blol3 eine Substa~~ppe, die zwei vizinale C-Atome enthalt, die beide zugleioh a- und ,&C-Atome sind : die Gruppe der ~~-Dioarbons~uren. In voriiegender Arbeit wird die Literatur und Geschichte moglichst kurz gehaften. An Stelle der ausfuhrlicheren Bespreohung verweisen wir auf die von H. v. Euler herausgegebene Mono- l*) Bioohem. Z. 83, 330 (1911). Ia) Liebigs Ann. 456, 2% (1923). 1') Vgl. 8. a. 0. s. 11. A. Szent-Gyorgyi, graphie: Euler, W. Franke, R. Nielsson und K. Ziele, Die Katalasen und die Enzyme der Oxydation und Reduktion (Verlag J. F. Bergmann, Miinchen 1934), sowie die Geschichte der Dehydro- genase und der Co-Dehydrasen von D. C. Harrison, Erg. d. Enzymforschung 4, 297 (1935). Als Zusammenfassung des Gesagten sei hier das oben an- gefuhrte Atmungsschema wiederholt, in dem, anlehnend an War- burgs), an Stelle des WKS die Reihe der Hiimatine eingetragen ist. Dieses Schema wird in der niichsten Zukunft wahrscheinlich noch duroh einen Zyklus ergiinzt werden, in dem die Fumarase ihre Wirkung ausubt. + Fe++-Fe+++-Fe++-Fe+++-Fe++-Fe'e+++-Fe++-Fe++f-ZZwischen- Cytochrom Cytochrom Atmungs- ferment Cytochrom substanz- Fumarat-Oxalacetat Fumardehydrase , Co-Dehydrase -N&.rstoffdehydrasen Co-Dehydrase + Nahrstoffe xethoaiaehea. Urn Wiederholungen vorzubeugen, sollen hier kurz die in den nach- folgenden Arbeiten meist gebrauchten allgemeinen Methoden beschrieben werden. Als Material diente der zerkleinerte, in Phosphat suspendierte Brust- muskel der Taube. Die Tiere wurden durch Dekapitieren getat.&, sogleich aufgespannt, der Brustmuskel mit einem scharfen Messer ausgeschnitten, einige Sekunden auf Eis gekiihlt, dann rasch in der eisgekiihlten Latapi- hackmaschine gemahlen. Diese Hackmaschine entspricht im Wesen den gew&nlichen Fleischhackmaschinen, mit dem Unterschied, daB das Gewebe nicht durch einen Wurm, sondern mit einem Kolben gegen die gelijcherte Scheibe angepreDt wird. Hierdurch wird die mechanische Schridigung des Gewebes weitgehend vermindert. Das Messer ist scharf und liegt genau der geliicherten Scheibe an. Der erhaltene Brei besteht aus distinkten Stiickcher des Gewebes. Die L&her an der Scheibe sind 1,5 mm im Durchmesser. DL Gewebestiickchen, die wir erhalten, sind aber kleiner, da die rasch rotierender 15) Warburg, Negelein u. Haas, Biochem. Z. 266, 1 (1933). Uber die Bedeutung der Bumarsilure fur die tierische Gewebeatmung. 17 Messer das in die Liioher dringende Gewebe in rascher Bolge abschneiden. Der Durchmesser des griiaten Teiles der Stiickchen liegt urn 43-05 mm*). Es ist wohl wichtig, diese Verhi&risse zu betonen, da ein so gemahlener Muskel von manohen Forsohern als em Gewebsbrei aufgefaBt wird, in dem die Zellstrnktur vernichtet ist. Dies trifft nicht zu. Der ,,Brei" besteht aus relativ i&&en ~websst~okche~ und kann mit den ~webssc~it~n ver- glichen werden. Solch ein Gewebsstiick ist eigentlich ein Gewebsschnitt, mit dem Unterschied, da3 der Schnitt nicht in einer, sondern in drei aufeinander aenkrechten Ebenen angelegt ist. Werden Leber oder Niere in dieser Weise zerkleinert, so enthalten die einzelnen Stiickchen im Durchschnitt 10000 Zellen**). Sollte das Muskelgewebe ,,gewaschen`" werden, so wurde der Brei im 20faohen Volumen destillierten, eisgektihlten Waasers suspendiert, hier unter sanftem Riihren 10 Minuten lang belaasen, dnrch ein Tuch filtriert und dann s,usgepreBt. Je nach Bediirfnis wurde dieses Waschen l-3mal wiederholt. Zum Zwecke der respirometrischen oder der Thunbergversuche wurde der gemahlene, gewasohene oder ungewaschene Muskel in 2,65/15 Mol. eis- gekiihlten Phosphats von pn 7 suspendiert. Auf je 10 g Gewebe wurden 30 corn Pufferkisung gebrauaht. Das Mahle~ und Sus~endieren wurde mog- lichst rasah ausgefiihrt und der Versuch wom6glich sogleioh vorgenommen, die Suspension son& bei O" bewahrt. Zum respirometrischen oder Thunbergversuch wurde von dieser Mus- kelsusp~sion stets 1,5 ecm (airhead 0,4 g Gewebe entsprechend) ab- pipettiert. Im VersuchsgetiB wurde das Volum mit Wasser oder sonstigen Zusiitzen stets auf 4 ccm aufgefiillt, so da3 die Endkonzentration des Phos- phats r/r6 Mol. entsprach. Die respirometrischen Versuche wurden, wo nicht anders hervor- gehoben, in dem mit SeitengefliD versehenen Barcroftapparat von 45 ml Volum vorgenommen (Pig. 1). Die CO, wurde durch em mit NaOH befeuch- tetes Filterpapier gebunden, das in einem Becherchen im Halse des Mano- meters an einem Stahldrahtbiigel aufgehiingt wurde***) (Pig. 1). Alle Verauohe wurden bei 37* ausgefiihrt. Es wurde stets 10 M.&ten vorgeschiittelt, dann die Hiihne gesohlossen und das Manometer alle 10 Minuten abgelesen. Ltinger als 1 Stunde wurden die Vermmhe - abgesehen van Annaus besonderen Experimenten - wegen AusschluS von Autolyse und Mikrobentiitigkeit nicht ausged~~t. *) Das MaB der Stiiakohen ist von dem Druoke und von der ~sch~~g keit der Messer abhangig. **) In der ~~p~~hle, wie sie in den Handel kommt, hat die gel&her& Scheibe eine konvexe, robe hintere Obqfliiche, die gegen eine zweite konkave Soheibe anliegt. Zwischen beiden l?l&hen wird der Gewebsbrei zermahlen, wodurch ein groi3er Teil der Zellen beach&d& wird. In unseren Versuchen wurde diese zweite konkape Soheibe entfernt, so da6 die Gewebsstiiekchen in dem Zustande weiter verwendet wurden, wie sie die geliicherte Scheibe passierten. ***) Die frtiher vonAmbrus,B~nga~dSzent-Gy6rgyi [Biochem. Z. 246, 473 (1931)J besohriebene Methode der Adsorption der CO, wurde ver- worfen, da sich das Abtropfen der Lauge nicht au~ch~e~n hi&, Hoppe-Seylefs Zeitwhrift f. physiol. Chemie. CCXXXVI. 2 18 A. Szent-Gyorgyi, Die Dehydrierungsversuche wurdea in den von mir friiher modi- fizierten Thunbergrohren vorgenommen. Da es niitig war, gr6Bere Serien von Versuchen unter vergleichbaren Bedingungen vorzunehmen, wurden je 12 Rohrchen im Sinne der Fig. 2 an ein weites, mit Hahn versehenes Rohr Fig. 1. Fig. 2. angeschmolzen. Diese Anordnung hat den groBen Vorteil, da3 sie es gestattet, gr6Bere Serienversuche unter identischem O,-Druck anzustellen. Der Barb- stoff wurde in die SeitengefiiBe einpipettiert und erst nach Evakuieren dem Gewebsbrei zugegeben. In unserer Arbeit war es lifters von Bedeutung, den der Dehydrierung entgegengesetzten ProzeB, die Hydrierung, zu messen. Zum Messen dieses Vorganges stand bis jetzt keine Apparatur zur Verfiigung. Bei diesem Versuch mu13 an Stelle von Farbstoff Leukofarbstoff dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Die Schwierigkeit des Versuches ist die, da3 das Ausmessen des Leukofarbstoffes in vacua vorgenommen werden mu3 Wir haben uns folgender, auf Fig. 3 dargestellter Apparatur bedient. Wie bei Fig. 2 wurden 12 Thunbergrohren an ein Hauptrohr angeschmolzen. Fig. 3. Gegeniiber jedem Rohr wurde ein kleines, blind endendes Rohrohen angebracht. Das Volumen dieses Riihrchens war 1,5 ml. Am einen Ende des Hauptrohres befand sich ein etwa 35 ml fassendes Gefiil3. In dieses wurde die k'arbstoff- liisung eingebracht. Nach erfolgter Evakuierung wurde aus dem Ansatzrohr Natriumhydrosulfitl6sung (Na,S,O,) zugelassen, bis der Farbstoff entfiirbt war. In einigen Versuchen war es notig, einen geringen Dberschull von Sulfit zu- zugeben, urn den Sauerstoff, der aus dem Muskel nicht giinzlich entfernt werden konnte, zu kompensieren. Durch Drehen seines Rezeptakels wurde die Leukofarbstofflosung in das lange zentrale Rohr einlaufen gelassen und fiillte die kurzen R5hrchen. Sein DberschuB wurde in das Reservoir zurtickgegossen. Durch entsprechendes tfiber die Bedeutung der Fumarsgure fiir die tierische Gewebsatmung. 19 Neigen des Apparates wurde nun die also verteilte ~~ofarba~ffl~sung den Versuchsriihren, in die der Muskelbrei mit sonstigen Zusatzen eingeftillt war, zugegossen. Die Farb&nderungen konnten nun im Wasserbade beobachtet werden. Nur die Reaktionsrohren werden in das Wasser verse&. Fiir be- sonderes Schtitteln war nicht gesorgt. Ab und zu wurde der ganze Apparat mit der Rand energisoh durchges~h~ttelt. I& der Apparat geniigend evakuiert, so sorgt das fortwshrende Kochen der Flussigkeit fur das notige Misohen. Je nach den Umstanden wurden verschiedene Farbstoffe ala Redox- Indicatoren verwendet. So&en ~hydr~erungen in Gegenwart von Fumarat naohgewiesen werden, so mu&e ein stark positiver Farbstoff verwendet werden, dessen Leukoform die Fumars&ure nicht mehr zu reoxydieren vermag, dessen E, also urn mindestens 109 mV positiver ist als das &`a des Su~ina~Fumarat- systems. Beliebig positiv konnte aber der Farbstoff such nicht sein, da urn 200 mV das Protoplasma stark zu reduzieren begi~t. Am gee&net&en wurde das l-~aphthol-2-su~onat-indo-Z,6-dichlorphenol gefunden, dessen Eke nach Gibbs, Cohen und Canna@) bei + 119 mV liegt (pu 7). Als Farbstoff von mittlerem E, wurde Methylenblau gebraueht. Als Farb- stoff negativeren Charakters wurde Indigo-Carmin (5,5'-Indigosulfonat) ver- wendet, dessen Ehe nach Sullivan, Cohen und Clarklr) bei - 125 mV lie@ (PR 7). Als stark negativer Farbstoff wurde das Neutralrot verwendet @ho = - 330)9. Als Co-Ferment die&e in alIen unseren Versuchen das von Baegais) nnd mir beschriebene, als Hg-Salz isolierte und iiber Phosphorwolframsllure gereinigte Co-Ferment der Milchsaureoxydation. Die Substanz wird kurz ,,Co-Dehydrase" genannt. Bei allen Versuchen wurden 0,5 mg dieser Sub- stanz verwendet. Das in dieser Arbeit gebrauchte Hy~ox~~marat und Hydroxymaleinat wurde nach der Methode von Wohl und &sterlin hergestelltaO). Es ist recht schwierig, oxymaleinatfreies Oxyfumarat oder oxyfumaratfreies Oxymalemat herzua~~en, da sich die Isomeren rasoh ineinander umwande~ und eme Gleiohgewichtsmischung geben. Die Reinheit kann durch den Schmelzpunkt beurteilt werden (Schmelzpunkt Oxyfumarat nach Wohl und Gsterlin 184O, Oxymaleinat 152@). Der Schmelzpu~t der gebrauchten Prgparate wird an entsprechender Stelle angegeben. In neutraler L&rung setzen sich beide Substanzen augenblicklich in die Ketoform urn, so d&3 wir unter ,,Oxalessigs&re" in vorliegender Arbeit eine frisch zubereitete neutrale L6sung des Gleichgewichtsgemisches van Oxy- fumarat und O~male~at verstehen*). lo) Hyg. Lab. Bull. Washington 161, 159 (1928). I?) Hyg. Lab. Bull. Washin~on 161, 78 (1928). I*) K. G. Stern, Tab. biol. 10, 4 (1934). lg) Diese Z. 217, 39 (1933). so) Ber. chem. Ges. 34, 1139 (1901). *) Ich bin ftir die Herstellung oiniger Praparate der I. G. Farben- industrie A.-G., Frankfurt a. M.-H&h&, zum Dar&e verbunden. Dieselbe Firma hat sioh auf meine Bitte hin bereit erkl&rt, diese Substanz ale Labora- toriumspriiparat herzustellen und hiervon auf besonderen Wnnsch kleinere Evzengen ais ,,Enol-oxal~~~u~` abzugeben. 2* 20 I. Banga, Es war bfters notig, zwischen Oxalacetat und Pyruvat zu unterscheiden, die beide eine identische Nitroprussidreaktion geben. Dies konnte mit Hilfe von Anilin geschehen, das bekanntlich Oxalacetat, nicht aber Pyruvat zersetzt. Wir l&en F'/,, Anilin im 0,Z mol.-pa S-Acetatpuffer und geben von dieser Losung gleiche Teile zur zu untersuchenden Fliissigkeit. Dann wird 15 Mmuten bei 37O bebriitet, mit NaOH alkalisiert, 2mal mit Ather aus- geschtittelt (wodurch das iiberschiissige A.r$in entfernt wird). Urn Wiederholungen zu vermeiden, sei noch ein Wort fiber die Fumarase gesagt. Wie bekanat, enthillt der Muskel, selbst such noch im gewaschenen Zustande, eine hochwirksame Fumarase. Wird also Pumarat dem Muskel zugesetzt, so wird, wenn keine ganz besonderen MalSnahmen getroffen werden, dieses in kiirzester Zeit zu s/4 in Apfelsaure umgesetzt und somit der Bestim- mung entzogen. Dasselbe gilt such fiir das natiirlich anwesende Fumarat. Die analytisch gefundenen Fumaratwerte miissen also stets mit 4 multipliziert werden, urn die gesamte, in der Oxydationsstufe des Fumarats befindliche Substanz zu ergeben. Diesen Wert, der also dem Vierfachen des analytisch gefundenen Pumarats entspricht, werden wir kurzweg als ,,l?umarat" (Fumarat in Anfiihrungszeichen) bezeicbnen.